Flash纯化时,什么时候需要使用ELSD(蒸发光散射检测器)?

进口实验室仪器色差仪 24-07-11 10:25:26

Flash快速色谱看似简单,但其实可能很复杂。溶剂选择、色谱柱大小、固定相、载样技术、梯度方法、流速和检测参数都是影响快速色谱和您成功使用该纯化技术的因素。在这些变量中,检测参数(即检测器类型)确确实实会很大程度地影响快速色谱的结果。尽管绝大多数小分子化合物(至少是药物发现实验室制造的化合物)在一个或多个波长上具有紫外线吸收,但随着更多底物的拓展,越来越多的合成和天然化合物几乎没有紫外吸收。当这种情况发生时,大多数化学家会添加不同的检测器,如蒸发光散射检测器(ELSD),以发现和分离此类样品。

然而,根据我的经验,对于许多被认为需要ELSD的化合物,当将DAD二极管阵列UV检测器(全波段扫描)调整到目标产物的适当波长范围时,可以提供足够高的灵敏度,从而保证样品的完整检测;属于这一类别的化合物类型包括一些脂类和萜烯,以及其他具有低紫外线吸收灵敏度的类似化合物。脂质体在近几年一直在新闻中出现,其是基于mRNA的新冠肺炎疫苗使用几种不同的脂质体化合物而制成,并且是一组通常认为需要非紫外线检测器或ELSD才能有效纯化的化合物。

事实上,ELSD检测可以提供预期的结果,但DAD全波长紫外线检测器也可以提供预期的结果,该检测器可以根据这些化合物的具体波长范围(198-810 nm)进行调整。下面我们通过具体的实例来验证波长聚焦检测代替ELSD的合理性,此次我们使用反相快速色谱技术纯化饱和脂肪酸酯-月桂酸甲酯(C12:0)、不饱和脂肪酸酯-油酸甲酯(C18:1)以及胆固醇,以上几种样品都是紫外信号比较弱的样品,是一种用于mRNA疫苗的脂质纳米颗粒混合物的脂质。

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胆固醇

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油酸甲酯

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月桂酸甲酯为了将两种检测方式进行对比,我们此次将波长聚焦的检测技术与ELSD结合使用,该技术使用窄波长范围进行积分加成检测,并在实际上提高了以上这些化合物的紫外吸收强度,其信号强度甚至可以直接媲美ELSD,见图1。

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图1 紫外波长聚焦检测(198-220 nm)和ELSD通过反相快速色谱纯化 脂质体混合物。尽管通过ELSD(绿色线)每种样品都可以有很好的吸收,但在Selekt紫外聚焦的条件下,月桂酸脂和油酸甲酯的酯基(黑色、红色和蓝色线)都可以被很强的检测到,并且不产生样品损失(和ELSD相比)。另外具有双键的化合物,如油酸甲酯和胆固醇,也会吸收紫外线并可检测,尽管波长很低,如图2所示。

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图2:每种纯化脂质的紫外光谱。紫外线吸光度范围为200 nm至220 nm。对于此类脂肪类化合物,它们的吸收波长往往在200 nm–220 nm之间,另外这种较窄的紫外吸收范围确实也会影响溶剂的选择,往往此时我们需要选择在该波长范围内没有紫外吸光度的溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、己烷、水)。因此此次我们使用水和甲醇进行上述色谱分析。那么,什么时候需要ELSD检测器呢?往往是在纯化那些不含紫外吸收官能团(例如酯)的饱和脂类化合物、饱和萜烯和其他不含紫外吸收基团的分子。但凡您的样品当中一个或者多种脂基羰基这种具有紫外吸收的基团,您都无需额外配置ELSD检测检测,通过Biotage紫外聚焦检测功能即可完成弱紫外吸收样品的分析和检测。/文:Biotage

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